Sequenciamento completo do Exoma
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Com o advento dos sequenciadores de nova geração e dos investimentos no Projeto Genoma Humano, a tarefa de sequenciar grandes regiões específicas de DNA passou a ser cada vez mais rápida e eficiente, podendo ser utilizada em larga escala como ferramenta no diagnóstico molecular de grande parte das doenças genéticas.

O que é um Exoma?

O termo Exoma refere-se ao conjunto de éxons presentes no genoma de grande parte dos seres vivos, composto por cerca de 180.000 éxons nos humanos. O genoma humano, em sua totalidade, apresenta cerca de três bilhões de pares de bases (A-T, C-G) e é constituído por regiões gênicas e intergênicas. Estima-se que na espécie humana existam cerca de 22.000 regiões gênicas ou genes propriamente ditos, que são a base formadora das proteínas.
Durante o processo evolutivo, os seres humanos herdaram um modo peculiar para a formação das proteínas. Este modo consiste em duas etapas principais em que as bases de DNA que formam os genes são transcritas em RNA e posteriormente processadas para excluir as partes chamadas íntrons e dar origem a moléculas de RNA maduras. O RNA maduro, conhecido como RNA mensageiro (mRNA), contém apenas as bases que codificarão diretamente as proteínas. Estas, por sua vez, são chamadas éxons. Ao todo, o somatório dos éxons representa aproximadamente 45 milhões de pares de bases.
O Sequenciamento Completo do Exoma consiste na análise dos éxons do DNA, que correspondem às regiões codificantes do mRNA.


Os éxons são as sequências de DNA traduzidas em proteínas, processo chamado de codificação

 

Qual a importância do Sequenciamento Completo do Exoma (SCE) na prática clínica?

85% das mutações causadoras de cerca de 6.000 doenças genéticas com padrão de herança mendeliano, conhecidas até o momento, ocorrem nos éxons, região analisada no SCE. Portanto, o SCE é um exame laboratorial eficiente para identificar causas genéticas de doenças ou deficiências.

Quais as principais indicações clínicas do Sequenciamento Completo do Exoma?

•  Casos de suspeita de doenças de caráter genético, já investigadas por outras metodologias, que permanecem sem conclusão

•  Casos de doenças com heterogeneidade genética, que são causadas por mutações em mais de um gene tornando os painéis de grupos de genes menos custo-efetivos que o SCE

•  Casos de apresentações clínicas atípicas, com sobreposição de sinais e sintomas, que podem ser causados por mutações ainda não descritas em genes conhecidos ou mais de uma variante em genes distintos

A grande vantagem do SCE está no fato de ser um exame robusto que analisa a maioria dos genes ao mesmo tempo, sendo capaz de identificar mutações em genes responsáveis por síndromes e diagnósticos raros.

Por se tratar de um exame bastante completo, que avalia cerca de 22.000 genes conhecidos até o momento, o SCE também é um exame de alto custo. Não só por sua técnica, mas também por sua extensa e complexa análise. Por este motivo quando há uma suspeita diagnóstica clara e bem direcionada e são poucos os genes associados a ela, é possível lançar mão de painéis de genes, exames também realizados pelo DLE com a mesma técnica de sequenciamento de nova geração. Estes painéis apresentam, na maioria das vezes, um menor custo e menor prazo de resultado, pois a quantidade de bases a serem sequenciadas e analisadas é menor.

Qual a metodologia do exame?

À época do Projeto Genoma Humano, finalizado no ano 2003, ainda se fazia o sequenciamento de forma bastante artesanal, com a análise de base a base das sequências geradas, com altos custos e grande dispêndio de tempo, tornando impossível a utilização em larga escala desta técnica para uso em diagnóstico clínico.

Em 2010, o SCE passou a ter uma aplicação em laboratório clínico por meio das técnicas de Sequenciamento de Nova Geração (do inglês Next Generation Sequencing - NGS). Com a automação do processo, a análise, que antes era realizada base a base, passa a ser muito mais rápida, gerando um número maior de variantes, média de 50.000 por indivíduo, analisadas por ferramentas computacionais de bioinformática.

Devido à complexidade e o grande número de dados se faz necessária a atuação de uma equipe multidisciplinar na correlação clínico-laboratorial, integrando especialistas em medicina laboratorial, bioinformática, genética molecular e genética médica, que atuam na triagem das mutações de relevância clínica e na elaboração e conclusão do laudo.

O DNA mitocondrial (mtDNA) também é analisado?

Sim, desde 1988 têm sido relatadas doenças causadas por mutações no mtDNA. Por este motivo, sua análise é igualmente importante e realizada juntamente à análise do exoma. A plataforma utilizada pelo Laboratório DLE sequencia os 13 genes codificadores presentes no DNA mitocondrial.

As mitocôndrias são organelas que desempenham funções essenciais para a homeostase celular e se destacam de outras organelas por possuírem seu próprio genoma, distinto do DNA nuclear.

Cada célula humana contém milhares de cópias de mtDNA embalado em um cromossomo circular dentro da organela mitocondrial e não no núcleo. O genoma mitocondrial possui particularidades, sendo sua herança exclusivamente materna.

Qual o papel da bioinformática na análise do SCE?

A combinação de algoritmos, softwares e infraestrutura computacional com múltiplos processadores, Gigabytes de memória e Terabytes de armazenamento de dados define o cenário atual da bioinformática na análise do SCE. Esta área é conhecida por desenvolver pipelines (fluxos de análises) que unificam diferentes técnicas computacionais, agrupam bancos de dados de mutações e informações clínicas trabalhando sempre com grande volume de dados, o que nos transporta para o mundo do BigData.

Por isso, o Laboratório DLE investiu em uma estrutura computacional robusta, física e em nuvem, que possibilita expandir com segurança e rapidez, mantendo sempre a disponibilidade do sistema e as aplicações de bioinformática.

O que esperar da interpretação do Sequenciamento Completo do Exoma?

Para interpretar um exame como o SCE é necessário ter em mente que são as variantes genéticas que tornam os indivíduos únicos. Todos os seres humanos que existiram no passado até o momento, carregam em seu DNA mutações que o identificam como indivíduo e que também podem potencialmente gerar as doenças genéticas. O grande desafio na interpretação do SCE para confecção de um laudo é definir dentre as cerca de 50.000 variantes detectadas na análise do DNA, qual é aquela responsável pela hipótese diagnóstica que motivou a solicitação do exame.

Devido a esta grande dificuldade, a comunidade científica internacional uniu esforços para criar fluxogramas de análises e bancos de dados, que são atualizados frequentemente para orientar a interpretação de cada variante encontrada. Devido ao caráter dinâmico da literatura científica mundial, a equipe do DLE realiza discussões periódicas para a elaboração e conclusão de um laudo específico para cada caso.

Além disso, mediante nova solicitação médica, há a possibilidade de reinterpretar, depois de um período de tempo, os dados brutos já sequenciados, lançando mão de novas publicações da literatura internacional e/ou novos sinais e sintomas apresentados pelo paciente, a fim de auxiliar o diagnóstico clínico.

O laudo final do DLE reporta as variantes com provável associação ao quadro clínico e às hipóteses diagnósticas informadas na solicitação. Também são reportadas no laudo, conforme desejo expresso pelo paciente no termo de consentimento informado, livre e esclarecido, as variantes de predisposição a outras condições genéticas, recomendadas pelo Colégio Americano de Genética Médica (ACMG - Recommendations for Reporting of Incidental Findings in Clinical Exome and Genome Sequencing), composto atualmente por 56 genes responsáveis por 24 diferentes patologias (N Engl J Med 370:25, 2014).

A equipe multidisciplinar do DLE que está diretamente envolvida na análise e interpretação do SCE é formada por médicos patologistas clínicos, bioinformatas, geneticistas moleculares e médicos geneticistas. Foram feitos grandes investimentos para ampliação da capacidade e estrutura técnica, a fim de realizar todas as etapas do Sequenciamento Completo do Exoma no Brasil.

Pelo caráter personalizado deste exame a equipe técnica do DLE está disponível para assessoria científica e esclarecimento de dúvidas técnicas que venham a ocorrer por parte do laboratório requisitante, pelo médico solicitante ou próprio paciente através do Este endereço de e-mail está protegido contra spambots. Você deve habilitar o JavaScript para visualizá-lo. ou 4020-8080 (Ao custo de uma ligação local de todo o Brasil).

Quais as limitações do exame?

São três as principais categorias de limitações do SCE:

•   A primeira é em relação às regiões do genoma não cobertas pelo sequenciamento

•   A segunda, aos tipos de alterações genéticas não avaliadas pelo exame

•   A terceira, à presença de variantes sem significado clínico conhecido ou VUS (do inglês, Variants of Unknown Significance)

O SCE é projetado para avaliar somente éxons e, portanto aquelas alterações que estiverem fora dos éxons e possam ser responsáveis pelo quadro clínico, apesar de serem uma pequena parte das doenças conhecidas atualmente, não são vistas pelo exame. Algumas regiões do DNA, que estão em éxons, podem apresentar uma variação de cobertura para cada paciente, sendo bem representadas ou não no sequenciamento, no entanto, essas regiões de baixa cobertura somam em média menos de 5% da amostra.

Como habitualmente realizado para todos os exames laboratoriais, no SCE é também necessária a avaliação dos valores de sensibilidade e especificidade analítica, reprodutibilidade, utilização de controles internos de qualidade e uso de teste de proficiência, nas diversas fases do exame.

O SCE é uma análise da sequência das bases do DNA, o que significa que alterações de número de cópias (microdeleções e microduplicações), alterações estruturais do cromossomo (inversões, translocações) e alterações epigenéticas (metilações, acetilações, alterações em estrutura de cromatina) não podem ser confirmadas na análise, podendo ser apenas suspeitadas, necessitando de confirmação por outras técnicas disponibilizadas pelo DLE, tais como CGH-Array, MLPA, Citogenética etc.

Devido à grande sensibilidade deste teste poderão ser detectadas alterações genéticas sobre as quais ainda não se tem dados suficientes na literatura médica mundial para interpretação detalhada. A equipe técnica do laboratório DLE irá indicar estes casos específicos, esclarecendo os limites da tecnologia e fazendo as recomendações necessárias no laudo.

A taxa de positividade está diretamente relacionada ao número de exames reportados em bancos de dados e a adequada indicação clínica. Um grande desafio durante a análise do exame está em separar as variantes que podem realmente estar relacionadas ao quadro clínico, tornando o processo de análise dos dados e conclusão do laudo uma tarefa bastante complexa.

Como solicitar o exame?

A requisição do exame deverá conter o maior número possível de informações, contendo no mínimo: motivo da investigação, principais hipóteses diagnósticas, dados clínicos, exames prévios do paciente e solicitação médica. O formulário específico e o termo de consentimento estão disponíveis para impressão clicando aqui.

A amostra pode ser colhida em qualquer cidade do Brasil e deverá chegar ao Laboratório DLE em até 60 horas, não sendo necessário refrigerar.

Material

  • Sangue total com EDTA (mínimo 4mL para crianças e até 8mL para adultos)
  • Sangue seco em papel filtro e swab de mucosa oral.
 

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